Première séance de travaux pratiques

LE NOYAU INTERPHASIQUE

BUT DU TP : Le but de cette première séance de TP est double :

- Elle va permettre d'illustrer le cours sur le noyau et de ses différents aspects au cours de la vie d'une cellule (cours de G.Salbert).

- Elle va permettre de familiariser les étudiants avec une technique de laboratoires simple basée sur le fractionnement cellulaire. Les étudiants peuvent ainsi purifier les noyaux de cellules hépatiques et préparer l'ADN à partir de ces noyaux.

I. Observation de lames
A. Coupe semi-fine de feuille de scolopendre colorée au bleu de Toluidine.
- Faire démonstration vidéo.
- Montrer cellules du limbe et cellules de la nervure.
- Rappels sur les constituants de la cellule végétale (paroi, vacuole, travées cytoplasmiques....)
- Décrire l'aspect des noyaux des deux types de cellules:
        chromatine diffuse (euchromatine).
        chromatine dense (hétérochromatine).
        nucléoplasme : milieu dans lequel se trouve la chromatine et le nucléole, lieu de synthèse des sous unités ribosomiques.
- Observation et un dessin d'une cellule de nervure et d'une cellule du limbe.

II. Fractionnement cellulaire
A- Matériel
1. Matériel biologique : foie de bœuf
2. Réactifs : NaCl 0,9%; Tampon TKM (Tris-HCl 50 mM, KCl 25 mM, MgCl₂ 5mM, pH 7,5; Saccharose 0,88 M et 1,1 M dans le tampon TKM
3. Autre matériel : Waring Blendor, centrifugeuse, filtres

B. Mode opératoire
1. Préparation des noyaux
- Par groupe environ 5 g de foie, laver le tissu par du NaCl 0,9%
- Homogénéiser au Warning Blendor (1 minute à vitesse maximale) dans du saccharose 0,88 M (10 ml par g de tissu)
- Filtrer sur plusieurs épaisseurs de gaze; répartir l'homogénat dans des tubes de 5 ml.
- Faire 1 prélèvement pour observation au microscope (Prélvt. 1).
- Centrifuger 10 minutes à 1000 g (2000 r.p.m)
- Eliminer le surnageant délicatement.
- Remettre le culot en suspension dans 2ml environ de saccharose 0,88 M à l'aide d'une pipette pasteur.
- Dans un autre tube de 5 ml, préparer un coussin de saccharose 1,1 M (2 ml).
- Déposer délicatement sur le coussin de saccharose, le matériel remis en suspension précédemment.
- Centrifuger 10 minutes à 1000g.
- Prélever une fraction de culot et du surnageant pour observation.
2. Extraction de la chromatine par NaCl 2M
- Remettre le culot en suspension dans 2 ml de NaCl 2M
- Centrifuger 10 minutes à 1000g
- Verser le surnageant contenant la chromatine dans un bêcher
3. Précipitation du DNA par l'éthanol
- Ajouter environ 3-4 volumes d'éthanol 95° froid dans le bêcher contenant la chromatne.
- Agiter doucement à l'aide d'un agitateur en verre
4. Traitement des prélèvements sur lame.
- fixer par la chaleur
- Monter dans une goutte de vert de Méthyle-pyronine (V.M.P)
- Comparer les prélèvements 1 et 2.
- Conclusions sur la méthode de fractionnement.

SEDIMENTATION SUR COUSSIN DE SACCHAROSE

PROPRIETES DES DIFFERENTS ORGANITES DES CELLULES HEPATIQUES