On utilise une colonne en verre équipée d'un verre fritté et
d'un robinet. La colonne est remplie d'une poudre, généralement
de l'alumine ou de la silice. Un mélange est placé en haut de
la colonne. Selon la nature de l'éluant et du contenu de la
colonne, certaines molécules sont plus facilement éluées que
d'autres.
2.1. Préparation de la colonne
Lorsqu'il n'y a pas de verre fritté dans le bas de la colonne,
il est nécessaire de boucher la colonne en plaçant un morceau
de coton. Le coton doit être placé avec une baguette en verre.
Remplissage de la colonne.
Lors de l'opération de remplissage, le plus délicat est d'avoir
une répartition la plus homogène possible de l'adsorbant.
Il faut éviter :
- D'avoir un remplissage de biais.
- Des trous dans le remplissage.
- Des bulles d'air.
Proportions
Utiliser 50g d'adsorbant pour 1g de produit à séparer. Doubler
voire quadrupler le rapport en cas de séparation difficile.
Il exsiste deux techniques de remplissage.
Lors du remplissage frapper les parois de façon à avoir un
tassement maximal.
Remplissage à sec
- Remplir la colonne aux deux tiers de solvant.
- Faire couler l’adsorbant dans la colonne à l’aide d’un
entonnoir en faisant attention à avoir une répartition homogène
dans la colonne.
- La colonne est prète lorsque le solvant surnageant au
dessus de l’adsorbant est de venu limpide.
Remplissage avec le solvant
- Préparer une bouillie en mélangeant dans un bécher l’adsorbant
dans le solvant.
- Placer cette bouillie dans la colonne à l’aide d’un entonnoir
en faisant attention à avoir une répartition homogène dans
la colonne.
- La colonne est prète lorsque le solvant surnageant au
dessus de l’adsorbant est devenu limpide.
2.2. Dépot des produits et élution
- Le solvant doit-être juste à la hauteur de l’adsorbant.
- Ajouter le mélange à étudier à l’aide d’une pipette Pasteur
tout doucement en évitant d'abimer la couche superficielle
d'adsorbant.
- Faire éluer à raison d'une goutte toutes les 5 secondes.
L'élution peut se faire selon un gradient de solvant polaire,
en faisant varier les proportions de solvant composant l'éluant.
Dans ce cas, la colonne doit être préparée avec le solvant le
moins polaire.
Dans certaines circonstances, on peut utiliser la technique
de la "chromato-flash", où, pour gagner du temps, on monte la
colonne sur une fiole à vide branchée sur une pompe.
2. Réalisation de la chromatographie
3. Chromato-Flash