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Méthodes
chromato-
graphiques |
 Chromatographie sur couche mince
Cette méthode très facile à mettre en oeuvre
est une des principales utilisées dans les laboratoires. Elle
présente l'avantage de ne nécessiter que peu de matériel et donner
des résultats facilement interprétables mais pas toujours très
reproductibles.
- Mode
opératoire
- Choix du
matériel
- Choix de l'éluant
- Chromatographie
- Révélation
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Expériences proposées
La chromatographie sur couche mince est la plus simple des
méthodes chromatographiques. Elle consiste à placer sur une
feuille (papier, silice ou autre, voir plus loin) une tache et de
la laisser éluer en la trempant dans un solvant ou un mélange de
solvant (appelé éluant), l’éluant diffuse le long du
support. La tache migre sur la feuille plus ou moins vite selon la
nature des interactions qu'elle subit de la part du support et de
l'éluant.
 
1. Principe de la chromatographie
La CCM est basée sur une interaction de type électrostatique
/ liaison hydrogène. Le principe du "qui se resssemble
s'assemble", souvent rencontré en chimie permet encore
d'expliquer ici la nature des phénomènes impliqués.
- Considérons dans un premier temps un support indifférent
(ce qui n'est pas le cas !). Dans la goutte, sont présents
plusieurs composés dont certains sont polaires (P), d'autre
moins, ou apolaires (A). Si l'éluant choisi est polaire, il
fera migrer plus facilement le composé P, ayant plus de
facilité à l'emmener dans la phase mobile.
On voit par cet exemple que la polarité de l'éluant tiens
un rôle décisif lors de la migration des composés.
- Considérons maintenant que la CCM est indifférente à
l'éluant (!). Si seul le support compte, tout dépend de la
nature des interactions entre les molécules du mélange et
celles composant le support. Il s'agit généralement
d'interactions de type liaison hydrogène. Supposons un support
donneur d'hydrogène (D). Si dans le mélange se trouve des
composés accepteur d'hydrogène (A), et d'autre indifférents
(I), migreront plus facilement les composés indifférents aux
liaisonx hydrogènes.
La situation est souvent bien plus complexe que celle
décrite dans les deux exemples précédents. Il n'existe donc
pas de théorie pour la CCM permettant de choisir le bon éluant
(c'est lui le plus dur à trouver !), le support étant
généralement de la silice.
2. Choix des conditions opératoires
2.1. Choix du support
1l en existe trois principaux : silice, alumine et cellulose.
Les supports sont généralement montés sur une plaque
d'aluminium. Certaines plaques possèdent un colorant incolore en
lumière naturelle mais de couleur verte en UV (ZnS absorbant à
256 nm).
Voici comment orienter son choix :
- Silice : c'est le support le plus courant. Il est
conseillé de toujours commencer par celui-là.
- Alumine : on l'utilise généralement pour les composés
à caractère basique.
- Cellulose : on l'utilise pour les composés fortement
polaires, comme les sucres ou les acides aminés.
2.2. Choix de l'éluant
Le choix de l'éluant est essentiel. Il n'est pas toujours
fourni avec le mode opératoire et il est important de savoir le
choisir. L'éluant est souvent un savant mélange de plusieurs (2
ou 3) solvants dans des proportions bien établies.
On a vu que le choix dépendait de la polarité. Voici le
classement des principaux solvants par caractère polaire
croissant.
- Ether de pétrole
- Cyclohexane
- Tétrachlorure de carbone
- Benzène
- Toluène
- Dichlorométhane
- Ether diéthylique
- Chloroforme
- Acétate d'éthyle
- Pyridine
- Acétone
- Ethanol
- Méthanol
- Eau
- Acide acétique
|
Solvants
apolaires
¯
Caractère
polaire
croissant
¯
Solvants
polaires |
Pour pouvoir comparer, voici à titre indicatif la
polarité relative des principales familles de molécules
organiques, par ordre croissant de polarité.
- Alcanes
- Dérivés halogénés
- Cétones, aldéhydes, éthers et esters
- Amides
- Amines
- Alcools
- Phénols
- Acide carboxyliques
|
Familes de
molécules
apolaires
¯
Caractère
polaire
croissant
¯
Familles de
molécules
polaires |
2.3. Que faire quand on a aucune information pour
réaliser la CCM ?
1. Le support à choisir est la silice.
2. Pour l'éluant, tester avec un mélange d'éther de pétrole
(apolaire) et d'acétate d'éthyle (polaire) dans des
proportions variées comme 100-0, 75-25, 50-50, 25-75, etc.
Affiner ensuite avec un solvant plus polaire si nécessaire
(acide acétique).
3. Réalisation d'une CCM
La CCM se déroule en trois étapes : préparation de la cuve,
préparation de la plaque, et élution.
3.1. Préparation de la cuve
 Un cuve de chromatographie se compose de la cuve et
d'un couvercle. Le couvercle sert d'une part à éviter
l'évaporation du solvant mais surtout à réaliser la CCM en
atmosphère saturée (pression de vapeur saturante du solvant), de
façon à avoir des valeurs reproductibles.
- Préparer l'éluant en respectant les proportions du mode
opératoire.
- En placer 5 mm dans le fond de la cuve puis fermer le
couvercle.
- Eventuellement placer un papier filtre verticalement
dans la cuve de façon à saturer l'atmosphère en vapeur de
solvant.
3.2. Préparation de la plaque
Prenons l'exemple d'une plaque sur laquelle 4 taches sont à
disposer.
- Découper une plaque aux dimensions raisonnables 8 cm
´ 5 cm.
- Tracer au crayon un trait à 1 cm du bas de la plaque.
- Sur ce trait tracer 4 petits points à 1 cm de distance
où seront déposés les taches.
- Déposer à l'aide d'une micropipette (ou pipette Pasteur)
les solutions sur chaque point, ou à l'aide d'un capillaire
fabriqué in situ avec en tube en verre.
Attention : les gouttes doivent être les plus petites
possibles.
Attention : ne jamais toucher la plaque avec les doigts,
surtout lors de la CCM d’acides a
-aminés, mettre de gants.
Remarque : si la solution est trop diluée,
mettre plusieurs gouttes au même point en prenant garde de
laisser sécher entre chaque
goutte.
3.3. Elution
- Placer la plaque dans la cuve, fermer et laisser
l'éluant diffuser.
- Arrêter la CCM lorsque le front d'éluant est arrivé à 1
cm du haut de la plaque (cette opération prend 15 min, mais
dépend du support et de l’éluant).
- Sortir la plaque et tracer au crayon le front de
l'éluant.
- Sécher la plaque au pistolet ou à la chaleur d’une
plaque chauffante.
4. Révélation
Certains composés sont colorés : il n'est pas nécessaire de
les révéler. La plupart sont incolores. Voici quelques méthodes
utilisées pour révéler les plaques.
4.1. Révélation UV
- Si la plaque est fluorescente, sous une lampe UV, toute
la plaque apparaît verte sauf là où sont les taches que l'on
entoure au crayon.
- Les dérivés aromatiques absorbent dans l'UV. Placer la
plaque sous une lampe UV et entourer les taches colorés.
4.2.. Révélation à l'iode
Beaucoup de composés organiques forment des taches
jaune-marron en présence d'iode. Dans un flacon, placer la
plaque et quelques cristaux d'iodes, puis boucher. Les taches
apparaissent.
4.3. Révélation par atomisation
Cette technique utilise un atomiseur contenant le révélateur
en solution. Selon le produit à révéler, la solution peut-être
:
- Ninhydrine pour les acides a
-aminés (taches violettes qui brunissent pour disparaître en
quelques jours)
- Acide sulfurique à 50% pour à peu près tout (taches
noires).
- On utilise aussi des mélanges complexes d'oxyde de
molybdène en présence de sulfate de cérium.
Précaution. Lorsque l'on pulvérulise le
révélateur sur la plaque, se placer à 20 cm de la plaque et
éviter toute formation de goutelettes. Le révélateur doit-être
appliqué en plusieurs pulvérisations.
5. Calculs et interprétation
La position finale da la tache (ou spot) est caractéristique
de la molécule.On lui attribue une valeur, le Rf de
Retention factor en anglais qui a été fort
habilement traduit comme Rapport frontal. Ce Rf
est le rapport de la distance parcourue par le composé divisé
par la distance parcourue par l’éluant.
| Front de
solvant |
| |
|
|
(Spot)
· |
| b |
|
|
a |
| ¯ |
¯
|
| Ligne de
départ |
Le Rf vaut : Rf = a / b
Le Rf est caractéristique d’une molécule pour un éluant et un
support donnés. Cette valeur servira d’authentique lors de CCM
d’identifications.
6. CCM à deux dimensions
Cette technique est souvent utilisée dans le cas de
l'hydrolyse d'une protéine. Le mélange à séparer contient un
grand nombre de composés que l'on veut séparer. Ici, une seule
tache doit révéler le maximum d'information.
- Dans un angle de la plaque, on réalise la tache.
- On laisse éluer dans un premier éluant.
- On tourne la plaque de 90° et on l'élue dans un deuxième
éluant.
On obtient alors une cartographie de la protéine.
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