Cette méthode très facile à mettre en oeuvre
est une des principales utilisées dans les laboratoires. Elle
présente l'avantage de ne nécessiter que peu de matériel et donner
des résultats facilement interprétables mais pas toujours très
reproductibles.
Mode
opératoire
Choix
du matériel
Choix de l'éluant
Chromatographie
Révélation
La chromatographie sur couche mince est la plus simple des méthodes
chromatographiques. Elle consiste à placer sur une feuille (papier,
silice ou autre, voir plus loin) une tache et de la laisser éluer
en la trempant dans un solvant ou un mélange de solvant (appelé
éluant), l’éluant diffuse le long du support. La tache
migre sur la feuille plus ou moins vite selon la nature des interactions
qu'elle subit de la part du support et de l'éluant.
1. Principe de la chromatographie
La CCM est basée sur une interaction de type électrostatique
/ liaison hydrogène. Le principe du "qui se resssemble s'assemble",
souvent rencontré en chimie permet encore d'expliquer ici la
nature des phénomènes impliqués.
Considérons dans un premier temps un support indifférent
(ce qui n'est pas le cas !). Dans la goutte, sont présents
plusieurs composés dont certains sont polaires (P), d'autre
moins, ou apolaires (A). Si l'éluant choisi est polaire, il
fera migrer plus facilement le composé P, ayant plus de facilité
à l'emmener dans la phase mobile.
On voit par cet exemple que la polarité de l'éluant tiens
un rôle décisif lors de la migration des composés.
Considérons maintenant que la CCM est indifférente à l'éluant
(!). Si seul le support compte, tout dépend de la nature des
interactions entre les molécules du mélange et celles composant
le support. Il s'agit généralement d'interactions de type
liaison hydrogène. Supposons un support donneur d'hydrogène
(D). Si dans le mélange se trouve des composés accepteur d'hydrogène
(A), et d'autre indifférents (I), migreront plus facilement
les composés indifférents aux liaisonx hydrogènes.
La situation est souvent bien plus complexe que celle décrite
dans les deux exemples précédents. Il n'existe donc pas de
théorie pour la CCM permettant de choisir le bon éluant (c'est
lui le plus dur à trouver !), le support étant généralement
de la silice.
2. Choix des conditions opératoires
2.1. Choix du support
1l en existe trois principaux : silice, alumine et cellulose.
Les supports sont généralement montés sur une plaque d'aluminium.
Certaines plaques possèdent un colorant incolore en lumière
naturelle mais de couleur verte en UV (ZnS absorbant à 256 nm).
Voici comment orienter son choix :
Silice : c'est le support le plus courant. Il est conseillé
de toujours commencer par celui-là.
Alumine : on l'utilise généralement pour les composés
à caractère basique.
Cellulose : on l'utilise pour les composés fortement
polaires, comme les sucres ou les acides aminés.
2.2. Choix de l'éluant
Le choix de l'éluant est essentiel. Il n'est pas toujours fourni
avec le mode opératoire et il est important de savoir le choisir.
L'éluant est souvent un savant mélange de plusieurs (2 ou 3)
solvants dans des proportions bien établies.
On a vu que le choix dépendait de la polarité. Voici le classement
des principaux solvants par caractère polaire croissant.
Ether de pétrole
Cyclohexane
Tétrachlorure de carbone
Benzène
Toluène
Dichlorométhane
Ether diéthylique
Chloroforme
Acétate d'éthyle
Pyridine
Acétone
Ethanol
Méthanol
Eau
Acide acétique
Solvants
apolaires
¯ Caractère
polaire
croissant ¯
Solvants
polaires
Pour pouvoir comparer, voici à titre indicatif la
polarité relative des principales familles de molécules organiques,
par ordre croissant de polarité.
Alcanes
Dérivés halogénés
Cétones, aldéhydes, éthers et esters
Amides
Amines
Alcools
Phénols
Acide carboxyliques
Familes de
molécules
apolaires
¯ Caractère
polaire
croissant
¯ Familles de
molécules
polaires
2.3. Que faire quand on a aucune information pour réaliser
la CCM ?
1. Le support à choisir est la silice.
2. Pour l'éluant, tester avec un mélange d'éther de pétrole
(apolaire) et d'acétate d'éthyle (polaire) dans des proportions
variées comme 100-0, 75-25, 50-50, 25-75, etc. Affiner ensuite
avec un solvant plus polaire si nécessaire (acide acétique).
3. Réalisation d'une CCM
La CCM se déroule en trois étapes : préparation de la cuve,
préparation de la plaque, et élution.
3.1. Préparation de la cuve
Un cuve de chromatographie se compose de la cuve et
d'un couvercle. Le couvercle sert d'une part à éviter l'évaporation
du solvant mais surtout à réaliser la CCM en atmosphère saturée
(pression de vapeur saturante du solvant), de façon à avoir
des valeurs reproductibles.
Préparer l'éluant en respectant les proportions du mode
opératoire.
En placer 5 mm dans le fond de la cuve puis fermer le
couvercle.
Eventuellement placer un papier filtre verticalement dans
la cuve de façon à saturer l'atmosphère en vapeur de solvant.
3.2. Préparation de la plaque
Prenons l'exemple d'une plaque sur laquelle 4 taches sont à
disposer.
Découper une plaque aux dimensions raisonnables 8 cm ´
5 cm.
Tracer au crayon un trait à 1 cm du bas de la plaque.
Sur ce trait tracer 4 petits points à 1 cm de distance
où seront déposés les taches.
Déposer à l'aide d'une micropipette (ou pipette Pasteur)
les solutions sur chaque point, ou à l'aide d'un capillaire
fabriqué in situ avec en tube en verre.
Attention : les gouttes doivent être les plus petites possibles.
Attention : ne jamais toucher la plaque avec les doigts,
surtout lors de la CCM d’acides a
-aminés, mettre de gants.
Remarque : si la solution est
trop diluée, mettre plusieurs gouttes au même point en prenant
garde de laisser sécher entre chaque goutte.
3.3. Elution
Placer la plaque dans la cuve, fermer et laisser l'éluant
diffuser.
Arrêter la CCM lorsque le front d'éluant est arrivé à
1 cm du haut de la plaque (cette opération prend 15 min,
mais dépend du support et de l’éluant).
Sortir la plaque et tracer au crayon le front de l'éluant.
Sécher la plaque au pistolet ou à la chaleur d’une plaque
chauffante.
4. Révélation
Certains composés sont colorés : il n'est pas nécessaire de
les révéler. La plupart sont incolores. Voici quelques méthodes
utilisées pour révéler les plaques.
4.1. Révélation UV
Si la plaque est fluorescente, sous une lampe UV, toute
la plaque apparaît verte sauf là où sont les taches que
l'on entoure au crayon.
Les dérivés aromatiques absorbent dans l'UV. Placer la
plaque sous une lampe UV et entourer les taches colorés.
4.2.. Révélation à l'iode
Beaucoup de composés organiques forment des taches jaune-marron
en présence d'iode. Dans un flacon, placer la plaque et quelques
cristaux d'iodes, puis boucher. Les taches apparaissent.
4.3. Révélation par atomisation
Cette technique utilise un atomiseur contenant le révélateur
en solution. Selon le produit à révéler, la solution peut-être
:
Ninhydrine pour les acides a
-aminés (taches violettes qui brunissent pour disparaître
en quelques jours)
Acide sulfurique à 50% pour à peu près tout (taches noires).
On utilise aussi des mélanges complexes d'oxyde de molybdène
en présence de sulfate de cérium.
Précaution. Lorsque l'on pulvérulise le révélateur
sur la plaque, se placer à 20 cm de la plaque et éviter toute
formation de goutelettes. Le révélateur doit-être appliqué
en plusieurs pulvérisations.
5. Calculs et interprétation
La position finale da la tache (ou spot) est caractéristique
de la molécule.On lui attribue une valeur, le Rf de Retention
factor en anglais qui a été fort habilement traduit comme
Rapport frontal. Ce Rf est le rapport de la distance
parcourue par le composé divisé par la distance parcourue par
l’éluant.
Front de solvant
(Spot)
·
b
a
¯
¯
Ligne de départ
Le Rf vaut : Rf = a / b
Le Rf est caractéristique d’une molécule pour un éluant et
un support donnés. Cette valeur servira d’authentique lors de
CCM d’identifications.
6. CCM à deux dimensions
Cette technique est souvent utilisée dans le cas de l'hydrolyse
d'une protéine. Le mélange à séparer contient un grand nombre
de composés que l'on veut séparer. Ici, une seule tache doit
révéler le maximum d'information.
Dans un angle de la plaque, on réalise la tache.
On laisse éluer dans un premier éluant.
On tourne la plaque de 90° et on l'élue dans un deuxième
éluant.
Chromatographie sur couche mince
Un cuve de chromatographie se compose de la cuve et
d'un couvercle. Le couvercle sert d'une part à éviter l'évaporation
du solvant mais surtout à réaliser la CCM en atmosphère saturée
(pression de vapeur saturante du solvant), de façon à avoir
des valeurs reproductibles.